MECP2-REAKTIVIERUNG: WARUM WERDEN MANCHE GENE REAKTIVIERT UND ANDERE NICHT?
Das Rett-Syndrom wird durch Mutationen in einer der beiden Kopien des MECP2-Gens auf dem X-Chromosom verursacht. Während der frühen Embryonalentwicklung inaktivieren weibliche Zellen zufällig eines ihrer X-Chromosomen, um die doppelte Dosis von zwei X-Chromosomen im Vergleich zu männlichen Zellen auszugleichen. Das bedeutet, dass kranke Zellen, die die mutierte Kopie von MECP2 exprimieren, auch eine gesunde oder Wildtyp-Kopie auf dem zum Schweigen gebrachten X-Chromosom enthalten. Die Erweckung bzw. Reaktivierung dieser unterdrückten Wildtyp-Kopie von MECP2 ist ein Bereich, der zunehmend wissenschaftliche Aufmerksamkeit erhält. Dies ist einer der sechs strategischen Heilungsansätze des Rett Syndrome Research Trust (RSRT).
Ich bin Hegias Mira-Bontenbal, Assistenzprofessor in der Gruppe von Joost Gribnau in der Abteilung für Entwicklungsbiologie am Erasmus University Medical Center in Rotterdam, Niederlande. Zusammen mit meinen Kollegen habe ich kürzlich eine Arbeit veröffentlicht, in der wir untersuchen, wie das MECP2-Gen in neuronalen Stammzellen (NSCs) der Maus reaktiviert wird. Vor einigen Jahren erhielten wir vom RSRT Mittel, um ein neues, empfindlicheres Modellsystem zur Untersuchung der MECP2-Reaktivierung zu schaffen. Die Gründe dafür waren vielfältig. Wir brauchten ein neues Mausmodell, mit dem wir die für Rett kritischen Zellen, die Neuronen, untersuchen konnten. Außerdem wollten wir ein neues Modell schaffen, bei dem wir anstelle eines fluoreszierenden Proteins zur Messung der X-Chromosomen-Reaktivierung (XCR) ein biolumineszierendes Protein verwenden konnten, das viel empfindlicher ist als Fluoreszenz oder andere verfügbare biolumineszierende Proteine. Biolumineszenz ist das Phänomen, durch das Glühwürmchen Licht erzeugen! Unser Ziel war es also, ein Modell zu entwickeln, mit dem wir nach Hunderttausenden von Medikamenten suchen können, die die stumme gesunde Kopie von MECP2 reaktivieren könnten.
Wir fusionierten das MECP2-Gen mit einem dualen Reportersystem, das ein sehr empfindliches biolumineszentes Protein, die Nanoluciferase, und ein anderes fluoreszierendes Protein, TdTomato, kombiniert, das, wie der Name schon sagt, rotes Fluoreszenzlicht erzeugt. Mit Hilfe von embryonalen Stammzellen erzeugten wir Mäuse, die diesen dualen Reporter trugen, und durch einen genetischen Trick erzwangen wir eine Inaktivierung des X-Chromosoms (XCI), die zur Inaktivierung des Reporters führte – was bedeutet, dass keine Zellen „Licht“ produzierten. Wir isolierten NSCs aus Mäuseembryonen und kultivierten sie, um sie vollständig zu charakterisieren. Um zu zeigen, dass unser System zur Reaktivierung von MECP2 verwendet werden kann, nutzten wir zwei Mechanismen, die zur Produktion von Biolumineszenz und Fluoreszenz aus unseren NSCs führten.
Wie bereits in der Vergangenheit von unseren RSRT-Kollegen veröffentlicht, reduzierten wir zunächst die Expression von Xist, einem für XCI entscheidenden Gen. Wir glaubten, wie andere auch, dass die Verringerung seiner Expression das X-Chromosom für eine Reaktivierung zugänglicher machen könnte. Und zweitens blockierten wir ein Enzym, das für die Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung wichtig ist. Bei der DNA-Methylierung handelt es sich um eine chemische Veränderung der DNA-Basenpaare – wir nennen sie eine epigenetische Veränderung. Die DNA-Methylierung an Stellen, an denen Gene beginnen, wird von den Zellen als ein „Ich sollte ausgeschaltet werden“-Signal erkannt und führt zur Unterdrückung der Gene. Die DNA-Methylierung ist also ein Mechanismus, mit dem die Zelle Gene auf dem X in einem unterdrückten Modus fixiert. Durch die Blockierung des Enzyms, das diese Funktion ausübt, wird die DNA-Methylierung reduziert oder beseitigt, was zur Reexpression der Gene führt.
Genau das ist bei MECP2 geschehen! Allerdings geschah dies nur bei einem kleinen Prozentsatz der Zellen und, wie erwartet, bei vielen anderen Genen auf dem X-Chromosom. Wir entdeckten 86 Gene unter den 2600 X-chromosomalen Genen, die entlang von MECP2 reaktiviert wurden, und waren fasziniert von den Eigenschaften, die sie gemeinsam hatten.
Warum wurden diese Gene leichter reaktiviert als andere? Welche Gemeinsamkeiten führen dazu, dass diese Gene reaktiviert werden und andere nicht? Wir untersuchten die epigenetischen und genetischen Merkmale, die diese reaktivierten Gene gemeinsam haben, und verglichen sie mit nicht reaktivierten Genen. Wir stellten fest, dass reaktivierte Gene tendenziell aktivere epigenetische Markierungen aufweisen, wenn sie sich auf dem aktiven X befinden: Sie sind wahrscheinlich effizienter bei der Rekrutierung von Faktoren, die für die Aktivierung wichtig sind. Auch einige kleine Regionen auf dem X waren im Vergleich zu anderen Regionen mit reaktivierten Genen angereichert. Obwohl wir einen Blocker des Enzyms, das die DNA-Methylierung aufrechterhält, verwendeten und eine globale Demethylierung beobachteten, gab es keine signifikante Demethylierung von Genen, die eine Reaktivierung zeigten. Dieses scheinbar widersprüchliche Ergebnis lässt sich mit der Tatsache vereinbaren, dass ein geringer Rückgang der DNA-Methylierung ausreichen könnte, damit Faktoren an Gene binden und diese reaktivieren.
Als wir uns auf die genomischen Merkmale der reaktivierten Gene konzentrierten, war die signifikanteste und überraschendste Korrelation mit den SINEs (short interspersed nuclear elements) festzustellen. Dabei handelt es sich um kleine repetitive Regionen, die häufiger in der Nähe von reaktivierten Genen zu finden waren als bei nicht reaktivierten Genen. Was diese SINEs für die Reaktivierung tun und wie das mechanistisch geschieht, ist noch eine offene Frage
Schließlich verglichen wir unsere Strategie für die XCR mit anderen veröffentlichten Techniken zur Reaktivierung des X, wie z. B. der Reprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen, und stellten fest, dass sich beide Pools reaktivierter Gene erheblich überschneiden, selbst wenn die Reprogrammierung von Fibroblasten ausgeht, einem ganz anderen Zelltyp als neuronale Stammzellen. Dies deutet darauf hin, dass die Reaktivierung des X-Chromosoms in verschiedenen Zelltypen oder mit verschiedenen Mitteln auf ähnlichen Wegen erfolgt.
Die nächsten Schritte bestehen nun darin, diese neuronalen Stammzellen oder daraus differenzierte Neuronen zu verwenden, um nach chemischen Verbindungen zu suchen, die effizienter zur MECP2-Reaktivierung führen. Aus dieser Studie geht auch hervor, dass ein gezielterer Ansatz für die MECP2-Reaktivierung erforderlich ist, um die Reaktivierung anderer X-gebundener Gene zu vermeiden. Die Unterbrechung von Xist könnte ebenfalls notwendig sein, um eine stabile Reaktivierung von MECP2 zu erreichen.
Wir freuen uns darauf, weiterhin zu diesem spannenden Forschungsgebiet beizutragen.
Referenzen:
- Mira-Bontenbal, H, et al., Genetic and epigenetic determinantsn of reactivation of Mecp2 and the inactive X chromosome in neural stem cells. Stem Cell Reports, 2022, Vol.17, 693-706.
- Carrette, LLG, et al., A mixed modality approach towards Xi reactivation for Rett syndrome and other X-linked disorders. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018. 115(4): p. 668-675.